每日消息!来自工程多能干细胞的CAR-NK细胞：为所有患者提供现成的治疗方法

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每日消息!来自工程多能干细胞的CAR-NK细胞：为所有患者提供现成的治疗方法

来源 : 默赛尔生物医学科技时间：2023-06-17 19:00:59

01CAR-T治疗的前景与挑战过继细胞转移（ACT）用于治疗人类疾病在过去几年中进展迅速，特别是在癌症方面。嵌合抗原受体（CAR），人工设计，在免疫效应细胞表面表达，作为GPS，将效应细胞重定向到其目标，如肿瘤，并彻底改变了ACT治疗领域。并且自体CD19 CAR-T细胞治疗血液系统恶性肿瘤，如慢性淋巴细胞白血病（CLL）、急性淋巴细胞白血病（ALL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）圆满成功。

而，CD19 CAR-T治疗的成功并不是没有副作用的。CD19 CAR-T细胞根除肿瘤导致多种炎症细胞因子的释放，包括IL-6和TNF-α，这被称为细胞因子释放综合征（CRS）。因此将CAR-T治疗从b细胞恶性肿瘤转化为其他肿瘤（包括其他血液恶性肿瘤）仍然面临着几个需要解决的障碍：

1.特异性

(相关资料图)

2.耐药性/逃逸

3.实体肿瘤

4.制造

02NK细胞【NK细胞作为同种异体治疗药物】NK细胞的细胞毒性受激活和抑制受体平衡的调节，在激活配体存在和抑制受体信号缺失的情况下，激活抑制受体可以有效地杀死异常细胞。与T细胞不同，NK细胞能够杀死缺失MHC I抗原“自身”标记物的细胞，而缺失MHC I标记物的有害细胞不能被T细胞检测和破坏。过继性NK细胞转移不需要严格的HLA匹配，而且缺乏导致GvHD的可能性，这是任何T细胞免疫治疗都面临的关键风险。因此，NK细胞可以成为现成的异体治疗药物。【CAR-NK与CAR-T】

与T细胞类似，NK细胞被表面表达CAR来靶向特定抗原，特异性增强其自然细胞毒性。

表1：

CAR-T	捐献的CAR-NK	PSC-CAR-NK
细胞来源	自体外周血	同种异体血和脐带血	异源性iPSC和hESC胞，无限的
生产时间、成本和可提供的剂量	耗时，成本高，单次剂量	现成的，低成本的，有限的多种剂量	现成的，非常低的成本，对所有病人的无限剂量的剂量
产品特性	异质	异质	同质
基因编辑/CAR	随机和可变	随机的和可变的，大量的细胞因病毒感染而死亡	统一，PSCs中的CAR/基因编辑-100%的CAR/基因编辑的NK细胞
癌症干细胞	没有优先目标	是的，优先瞄准	是的，优先瞄准
杀伤机制	car介导的细胞杀伤	CAR和NK受体介导的细胞杀伤	CAR和NK受体介导的细胞杀伤，以及基因编辑
安全性:CRS	高	低	低
GvHD	高，具有同种异体细胞	低的，甚至有同种异体细胞	低的，甚至有同种异体细胞
主细胞库	无	无	是的：用于各种目标的PSC-CAR细胞库

【挑战】1.供体NK细胞的主要来源是外周血（PB）和UCB，但其所含NK细胞数量极少。虽然体外指数扩张有/没有人工抗原提呈细胞（aAPC）从一个供者能够提供足够的细胞单一或一个数量有限的病人，剂量仍然是有限的单供体采血。 2.不同供体之间的功能和扩展差异增加了批次对批验证和制造延迟的负担，从而导致不一致的临床结果。 3.用病毒CAR构建物转染NK细胞与低水平或可变水平的转基因表达和对细胞活力的不利影响相关，限制了其他基因工程来提高CAR-NK细胞的疗效。 4.24种NK细胞系，如NK9-2，已被追求用于临床应用。这些细胞本质上是癌变的，在注射给患者之前需要进行照射，这削弱了它们对癌症的杀伤能力。 03来自PSCs的CAR-NK

在分化的PSC培养中，已发现造血前体以及成熟的红系、髓系、巨噬细胞、巨核细胞和淋巴系。PSC-NK细胞能够在细胞因子刺激下分泌IFNγ，并对多种类型的癌细胞具有强大的自然细胞毒性，并在异种移植小鼠模型中显示出抗肿瘤活性。与PB-NK细胞相比，一些细胞组也成功地将PSC分化为表型相似的NK细胞，如NK相关受体表型和效应功能。

PSC为NK细胞等基因工程细胞产物的生成提供了一个全新的途径。与基于供体的CAR-NK细胞相比，PSC-CAR-NK有几个优势（表1）

04PSC-NK细胞工业规模生产的3D平台

我们开发了一种新的3d生物反应器平台，可以有效地将人PSCs在单一生物反应器中连续转化为高纯度的NK细胞（图1）。这种分化系统使用明确的无血清培养基,并消除了任何饲养细胞的使用。首先，人类造血干细胞从2D单层培养适应于3D球体，并在生物反应器中扩大，然后3D造血干细胞球体被诱导为中胚层系分化，将60-70%的造血干细胞转化为血细胞。60-70%的PSCs变成了造血内皮细胞祖细胞（CD31+ CD144+ CD34+）。然后将造血内皮细胞转换到造血和NK细胞分化条件下，持续长达35-45天。从大约第15天开始，NK细胞从这些3D球中释放出来，并持续4周，并通过简单的离心收集释放出来的NK细胞（图1）。释放的PSC-NK细胞表现出明显的同质形态，并表达了典型NK细胞特有的基因特征。收集到的细胞中超过95%表达CD56，并激活NKG2D、NKp44和NKp46的受体（图2）。这些CD56+ PSC-NK细胞不表达TCR和CD3的T细胞标记，也不表达B细胞标记CD19；而超过60%的CD56+ PSC-NK细胞也表达CD8α（图2），而PB CD56+NK细胞的表达率为30%,NK细胞的增加与艾滋病患者的疾病消退有关。我们用300毫升的生物反应器可重复生成10¹⁰个纯NK 细胞，并且这个过程已经在多个具有/不具有基因编辑或CAR的hESC和iPSC系中重复进行。

体外实验表明，生物反应器产生的PSC-NK细胞能够分泌IFNγ，表达CD107a（脱颗粒），并对白血病细胞、胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌和肺癌等多种肿瘤细胞表现出强大的天然细胞毒性。我们还证明了PSC-NK细胞具有抗病毒活性，并特异性地杀死感染甲型流感、登革热、寨卡病毒和HIV病毒的正常细胞，但不杀死未感染的正常细胞。该3D PSC-NK制造平台使用定义的材料，不含血清或饲养细胞，可扩展和可重复用于生成同质功能NK细胞。随着永久主PSC-CAR细胞系的建立，这种新型技术平台将为产生适合大量患者治疗的现成CAR-NK细胞提供取之不尽的细胞来源，从而使细胞免疫治疗领域发生革命性的变化。

图1 在3D生物反应器中，多能干细胞（PSC）向造血内皮细胞（HE）、造血祖细胞和NK细胞的顺序分化。A，方案显示了用于3D-PSC分化为造血内皮、造血祖细胞和NK细胞的大约时间和逐步策略。B，不同阶段的形态学和特异性基因的表达。SLT，继发性淋巴组织。图2 iPS细胞-NK细胞分析。A，从未经纯化的3d-生物反应器中收集的iPS-NK细胞的形态。B，iPS-NK细胞具有代表性的正向和位点散射图。C-J，(C) CD56 (y)和TCR (x)的iPS-NK细胞代表性流式细胞术图；(D) CD56(y)和CD3(x)；(E) CD19 (y)和PE偶联抗体控制(x)；(F) CD8(y)和CD4(x)；(G) CD56(y)和NKG2D (x)；(H) CD56(y)和NKp44(x)；(I) CD56(y)和NKp46(x)和(J) CD56(y)和KIR2DL1(y)1/DS1(x) 05优化

从PSCs衍生的细胞产品的成功临床应用将需要PSCs向特定的细胞类型进行有效和可控的分化，并产生一个同质的细胞群。我们的3D PSC-NK技术提供了一个可扩展的、一致的、高效的和具有成本效益的制造平台，以产生同质的功能性NK细胞。如图3所示，GMP级PSC系可在多能阶段进行基因操纵，以增强最终NK细胞产品的持久性和细胞毒性。基因编辑的PSC系可以进一步设计出针对不同癌症抗原和病毒抗原或自体活性T细胞的CAR，以及针对自体活性B细胞的嵌合自体抗体受体（CAAR）。建立多个针对不同特定抗原的主PSC-CAR细胞库，将为制造真正异源的现成CAR-NK细胞提供取之不尽的细胞来源，可以在全球范围内迅速部署到癌症、感染和自身免疫性疾病患者。

图3基因工程PSC-CAR-NK细胞对癌症、病毒感染和自身免疫性疾病的治疗策略未来的工作旨在开发更大的 (>5 L)的生物反应器和物流，最终目标是使普通患者能够负担得起CARNK产品，并像传统药物一样容易处理。最终目标是使CARNK产品成为普通病人可以负担得起的产品，并且像传统药物一样容易处理。来源：Lu SJ, Feng Q. CAR-NK cells from engineered pluripotent stem cells: Off-the-shelf therapeutics for all patients. Stem Cells Transl Med. 2021 Nov;10 Suppl 2(Suppl 2):S10-S17. doi: 10.1002/sctm.21-0135. PMID: 34724715; PMCID: PMC8560199. 默赛尔生物微信平台来源：默赛尔生物研发部主编：默赛尔生物研发部 E-mail：wechat@morecell.com.cn

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深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司以大规模工业级NK细胞的制备为基础技术平台，为生物技术企业、医疗机构、高校和科研院所，提供全领域细胞治疗产品和系统性技术解决方案的国家级高新技术企业。技术团队由战略科学家、科技领军人才和高技能专业人才组成，在恶性肿瘤、自体免疫性疾病、乙型肝炎的免疫细胞治疗以及组织损伤、退行性疾病的干细胞治疗等领域，进行关键技术的研究开发和产品生产应用，技术实力达到国际先进、国内领先水平。一流水平的“细胞治疗研发中心” （近1500㎡）高洁净度、高标准的cGMP实验室两个（近1000㎡）

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